今年上半年國內一研究機構向我司采購了一套倒置顯微鏡觀察系統(tǒng)，包含了一臺倒置熒光顯微鏡、CCD相機、恒溫熱臺等。今年上半年我司接到一個來電，咨詢倒置顯微鏡，需要采購一套，但是由于咨詢人員不了解顯微鏡，沒有給我們明確的顯微鏡配置要求。于是我司安排專業(yè)的技術人員與她溝通，經過仔細了解才知道他們是用來研究人體胚胎的，旨在找出不孕不育癥的治療良方。恰好，我司在這方面的應用已經有一定的經驗，于是我們技術員向這位貴賓詳細解釋了顯微注射的原理和操作步驟。
所謂顯微注射就是在顯微鏡下挑選活力較佳的精子，將精子直接注射成熟的卵子內，然后將其重新放回婦女的子宮，從而提高受孕幾率。這項技術的詳細過程如下：
第1步.顯微注射系統(tǒng)最主要的儀器包括倒置顯微鏡和置于它兩側的顯微操作儀。倒置顯微鏡的光學系統(tǒng)應具有三維立體視覺，對精子形態(tài)觀察可以細致入微，辨別優(yōu)劣。載物臺配置37℃恒溫透明載物臺，以保證注射時卵子的溫度恒定。操作儀的持卵側容易控制，持卵針可自己拉制。持卵針的前端要平滑，內徑要小，以免吸進卵細胞質。持卵針外徑要比卵的直徑略小為宜。
操作儀的注射有兩個關鍵性問題要注意：
第一，注射側的整個壓力傳導系統(tǒng)一定要密閉，且操作要靈敏。傳導系統(tǒng)的塑料管內充填的 無論是油質還是水質材料以不產生氣泡為佳。一旦有氣泡產生，說明壓力傳導系統(tǒng)有漏氣，定將導致精子的吸入和推出不能控制自如，注射過程不能順利完成。注射系統(tǒng)的塑料管是透明的，有氣泡能及時發(fā)現。固定注射針的固定器有金屬和有機玻璃兩種，有機玻璃的固定器是透明的，如有氣泡產生易于發(fā)現而及時排除。但使用何種操作系統(tǒng)，要根據操作者的習慣來選擇。
第二個關鍵性問題是注射針的質量，注射針口徑的大小和注射針尖的銳利程度關系到精子注入的成敗，一旦發(fā)現針的質量有問題，不可勉強湊合使用，應及時更換。
第2步.精子制動與注射持卵針和注射針分別安裝到固定器上，持卵針和注射針要調至一個平面水平，左右呈一條直線。注射針的前端要與皿底平行。
第3步.將準備好的上游精子用拉制好的細玻璃管吸幾個微升至培養(yǎng)皿中的PVP滴中，在20倍物鏡下尋找形態(tài)正常、游動的精子，用注射針的前端貼培養(yǎng)皿底壓住精子尾部中段，注射針對尾部施壓摩擦至擦破尾部的質膜，然后先尾部后頭部將精子緩慢吸入注射針前端。精子制動目的不僅使注射針易于控制精子的吸人，另一目的是從尾部擦破點釋放出的精子細胞質和卵子的激活有關。
第4步.準確無誤地將質量好的精子吸入注射針前端，并能控制精子在前端移動速度至關重要，控制精子的移動要達到從PVP滴移到培養(yǎng)液小滴的過程中不丟失精子。如果能在注射針中一次轉移三個精子，且各精子之間保持一定距離，就可以加快注射速度和縮短卵子在培養(yǎng)箱外的時間。卵子在培養(yǎng)箱外的時間不宜超過30分鐘，最好每組卵注射時間在15分鐘內完成，并及時將已注射的卵放回培養(yǎng)箱中。卵子放人注射皿的時間和方式根據操作者自己來定，只是要注意對卵子的保護問題。筆者的體會是，最好是注射針從PVP滴吸好精子轉移至培養(yǎng)滴后，以嘴吸控制的方式將卵子移進位于顯微鏡載物臺上的注射皿中，以防從載物臺移開注射皿，造成注射針多次暴露在空氣中易引起注射針的堵塞或污染。
第5步.在低倍鏡下將吸有精子的注射針以移動注射皿的方式進入放有卵子的培養(yǎng)滴，持卵針降下到皿底的培養(yǎng)液滴吸住卵子，將第二極體定位在7點的位置。從理論上講，紡錘絲在第二極體下方，但實際上極體可能錯位，如果能在偏振光顯微鏡頭的監(jiān)察下避開紡錘絲注射更為理想。好的持卵針能穩(wěn)固地吸牢卵子，卵子可接觸皿底，也可懸空，兩種位置都不影響注射。
完成上述工作，鏡頭換成高倍鏡，清楚聚焦3點鐘位置的透明帶和注射針尖。緩慢將精子推向針尖并快速刺入卵細胞內。卵的質膜具有高度韌性和彈性，往往針尖已深達9點的位置卵膜仍然不破。質膜已破的標準是回吸精子時卵細胞質無阻礙順暢地流進針管，此時即可向卵細胞質內注射精子，如質膜未破則將針退回到透明帶3點處換方向再行穿刺，直到將質膜刺穿精子被注射進卵子細胞質內，隨后才可能發(fā)生受精過程。質膜不破，精子留在注射過程形成的質膜凹陷內，卵子不能受精。
第6步.精子注射5至6小時后，可形成雌性和雄性原核。在臨床的IVF中心，一般注射后第二天清晨檢查受精情況。平均顯微注射受精成功率應在80%以上，其中一個雌性原核一個雄性原核的2PN受精卵占總受精的90%左右;兩個雌性原核(第二極體、未排卵)一個雄性原核的3PN受精卵時有發(fā)生，約占5%一10%，個別情況可達30%;l PN發(fā)生的情況約占5%。注射后第二天晨觀察到的受精卵的兩個原核應已經靠近，如果離的較遠預示發(fā)育不良。
通過上述詳細的介紹，這位老師非常認同我司技術人員的專業(yè)知識和專業(yè)嚴謹的服務態(tài)度，立刻決定向我司采購本套產品。一個月后我司人員上門安裝此套產品，到目前使用情況，客戶反應良好。
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