倒置熒光顯微鏡搭配熒光蛋白能可視化觀察活細(xì)胞的細(xì)胞器,而想達(dá)到更精細(xì)的特定目標(biāo)細(xì)胞或特定部分進(jìn)行標(biāo)記示蹤,則需要用到光激活、光轉(zhuǎn)化或光控開(kāi)關(guān)熒光蛋白,一般這需要共聚焦顯微鏡或者超分辨顯微鏡,但也有方法可以用普通的倒置熒光顯微鏡(寬場(chǎng)熒光)觀察,今天我們就來(lái)跟大家介紹一下。
光轉(zhuǎn)化熒光蛋白mEos2轉(zhuǎn)化觀察
·光轉(zhuǎn)化熒光蛋白
光轉(zhuǎn)化熒光蛋白Kaede有兩個(gè)激發(fā)峰,兩個(gè)發(fā)射峰
光轉(zhuǎn)化熒光蛋白是超分辨成像常用的染料,以Kaede為例,在激發(fā)光照射下,會(huì)發(fā)出綠色熒光,而用紫外照射后,會(huì)不可逆地轉(zhuǎn)化為紅色熒光。這種特性可以讓研究人員界定特定的細(xì)胞,或細(xì)胞的特定部分,作為ROI。
光轉(zhuǎn)化熒光蛋白多來(lái)自珊瑚
這種綠紅轉(zhuǎn)化的熒光蛋白來(lái)自珊瑚,因其轉(zhuǎn)化跟秋天的楓葉從綠變紅相似,故而得名Kaede(楓葉),但由于性質(zhì)限制,Kaede并不是可靠易用的商用活細(xì)胞染色劑。在超分辨成像中常用的光轉(zhuǎn)化熒光蛋白主要有Dendra2、mEos2、和mKikGR三種。
Dendra2熒光光譜更符合常規(guī)激發(fā)塊設(shè)計(jì)
·為什么用寬場(chǎng)熒光顯微鏡?
研究級(jí)倒置熒光顯微鏡MF53-N(寬場(chǎng)熒光)
一般的熒光顯微鏡都是寬場(chǎng)熒光顯微鏡,相比共聚焦顯微鏡,它的Z軸分辨率沒(méi)有那么高,高倍放大下成像會(huì)有焦外激發(fā)形成的光暈,無(wú)法獲得邊緣非常銳利的熒光成像。
但熒光顯微鏡觀察光轉(zhuǎn)化熒光蛋白有幾個(gè)好處,首先熒光顯微鏡的儀器成本要比共聚焦低得多,而且相對(duì)簡(jiǎn)便易用,是相對(duì)更普及的儀器設(shè)備。
長(zhǎng)通U激發(fā)下的蕨葉,可見(jiàn)多色熒光
此外,共聚焦顯微鏡為了追求精度,通常無(wú)法在操作光轉(zhuǎn)化的同時(shí)觀察轉(zhuǎn)化情況。而熒光顯微鏡的U紫外激發(fā)塊配置,很多用的是LP長(zhǎng)通發(fā)射濾光片,可以同時(shí)顯示藍(lán)色發(fā)射到紅色發(fā)射,可以在操作光轉(zhuǎn)化同時(shí)觀察轉(zhuǎn)化情況。
·熒光顯微鏡如何觀察光轉(zhuǎn)化熒光蛋白
研究級(jí)熒光顯微鏡MF43-N
熒光顯微鏡想要觀察光轉(zhuǎn)化熒光蛋白,先決條件是有多色激發(fā)塊配置,并且熒光光路有視場(chǎng)光闌,用長(zhǎng)通配置的U激發(fā)塊(DAPI激發(fā)塊),這可能需要研究級(jí)的熒光顯微鏡。
Connexin43-Dendra2揭示縫隙連接蛋白Cx動(dòng)態(tài)
轉(zhuǎn)化前的成像和準(zhǔn)備:
1、關(guān)燈準(zhǔn)備暗室成像,讓眼睛適應(yīng)暗室。
2、切換激發(fā)塊到藍(lán)色激發(fā)波長(zhǎng)。
3、LED熒光光源把亮度調(diào)低,然后關(guān)掉;汞燈光源請(qǐng)插入ND濾光鏡。關(guān)閉激發(fā)光擋板(如有)。
4、轉(zhuǎn)換為100X油浸物鏡或其他高倍物鏡,油鏡加油。
5、放置準(zhǔn)備好的樣品。
6、使用相襯觀察,對(duì)焦到細(xì)胞上,把轉(zhuǎn)化目標(biāo)移到視野中間。
7、LED熒光光源打開(kāi)激發(fā)光;汞燈光源打開(kāi)激發(fā)光擋板(如有);
8、調(diào)節(jié)到合適參數(shù),拍照,獲得轉(zhuǎn)化處理前綠色熒光圖像。
9、切換激發(fā)塊到綠色激發(fā)波長(zhǎng),調(diào)節(jié)參數(shù)拍攝紅色熒光圖像。通常沒(méi)有或少量紅色熒光。
Dendra2-H2B揭示組蛋白H2B非常穩(wěn)定
操作觀察轉(zhuǎn)化熒光蛋白和成像:
1、相襯觀察,確認(rèn)目標(biāo)在視野中間。
2、收小熒光光路的視場(chǎng)光闌,以將熒光照射范圍縮小到視野中間。
3、切換激發(fā)塊到紫外波長(zhǎng),調(diào)高LED熒光光源亮度,汞燈要拔出ND減光鏡??梢栽谀跨R下看到綠色熒光向紅色熒光轉(zhuǎn)化,可以調(diào)節(jié)熒光光路的視場(chǎng)光闌控制轉(zhuǎn)化區(qū)域大小,轉(zhuǎn)化時(shí)間可能耗時(shí)5-10秒,視乎紫外光源的強(qiáng)度。
4、切換到B激發(fā)塊,打開(kāi)熒光光路視場(chǎng)光闌,拍攝綠色熒光,切換到G激發(fā)塊拍攝紅色熒光,現(xiàn)在應(yīng)該可以看到明顯的紅色熒光。
5、設(shè)定時(shí)間間隔,拍攝綠色和紅色熒光,即可對(duì)特定細(xì)胞或者蛋白的變化進(jìn)行研究了。
Dendra2-α-tubulin示蹤微管蛋白動(dòng)態(tài)聚合和分離
利用這套工作流,你還可以觀察光激活蛋白、FRET熒光共振能量轉(zhuǎn)移、光控開(kāi)關(guān)熒光蛋白,對(duì)于一些比較宏觀的教學(xué)和研究都非常方便。
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