熒光現(xiàn)象
熒光是指熒光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)光照射下,幾乎同時(shí)發(fā)射出波長(zhǎng)更長(zhǎng)光的過程(圖1)。當(dāng)特定波長(zhǎng)(激發(fā)波長(zhǎng))的光照射一個(gè)分子(如熒光團(tuán)中的分子)時(shí),光子能量被該分子的電子吸收。接著,電子從基態(tài)(S0)躍遷至較高的能級(jí),即激發(fā)態(tài)(S1’)。這個(gè)過程稱為激發(fā)①。電子在激發(fā)態(tài)停留10-9–10-8秒,在此過程中電子損失一些能量②。電子離開激發(fā)態(tài)(S1)并回到基態(tài)的過程中③,會(huì)釋放出激發(fā)過程中吸收的剩余能量。
熒光雅布倫斯基圖
熒光分子在激發(fā)態(tài)駐留的時(shí)間為熒光壽命,一般為納秒級(jí)別,是熒光分子本身固有的特性。利用熒光壽命進(jìn)行成像的技術(shù)叫熒光壽命成像(Fluorescence Lifetime Imaging,F(xiàn)LIM),可以在熒光強(qiáng)度成像之外,更加深入地進(jìn)行功能性測(cè)量,獲取分子構(gòu)象、分子間相互作用、分子所處微環(huán)境等常規(guī)光學(xué)成像難以獲得的信息。
熒光的另一個(gè)重要特性是Stokes位移,即激發(fā)峰和發(fā)射峰之間的波長(zhǎng)差異(圖2)。通常發(fā)射光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)。這是由于熒光物質(zhì)被激發(fā)之后、釋放光子之前,電子經(jīng)過弛豫過程會(huì)損耗一部分能量。具有較大Stokes位移的熒光物質(zhì)更易于在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
熒光顯微鏡是利用熒光特性進(jìn)行觀察、成像的光學(xué)顯微鏡,廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)等各領(lǐng)域。熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點(diǎn),非常適合進(jìn)行特定蛋白、細(xì)胞器等在組織及細(xì)胞中的分布的觀察,共定位和相互作用的研究,離子濃度變化等生命動(dòng)態(tài)過程的追蹤等等。
細(xì)胞中大部分分子不發(fā)熒光,想要觀察它們,進(jìn)行熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記的方法非常多,可以直接標(biāo)記(比如使用DAPI標(biāo)記DNA),或利用抗體抗原結(jié)合特性進(jìn)行免疫染色,也可以用熒光蛋白(如GFP,綠色熒光蛋白)標(biāo)記目標(biāo)蛋白,還可以用可逆結(jié)合的合成染料(如Fura-2)等。
明美倒置熒光顯微鏡MF53-N
目前熒光顯微鏡已成為各個(gè)實(shí)驗(yàn)室及成像平臺(tái)的標(biāo)配成像設(shè)備,是我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)的好幫手。熒光顯微鏡主要分為三大類:正置熒光顯微鏡(適合切片)、倒置熒光顯微鏡(適合活細(xì)胞,兼顧切片)、熒光體視鏡(適合較大標(biāo)本,如植物、斑馬魚(成體/胚胎)、青鳉、小鼠/大鼠器官等)。
熒光顯微成像技術(shù)應(yīng)用廣泛,種類豐富,而且新技術(shù)還在不斷涌現(xiàn),大家可以選擇的技術(shù)去完成自己的研究。
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